Estandarización de una prueba de PCR en tiempo real múltiple para la identificación de Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum.

Abstract

Introducción. Angiostrongylus spp. son parásitos que se encuentran en todo el mundo y pueden causar enfermedades. Algunas especies patógenas están emergiendo y re-emergiendo en países del Caribe y Sudamérica, donde se asocian con la presencia del caracol Achatina (= Lissachatina) fulica. Los métodos diagnósticos para las angiostrogilosis son escasos, con baja sensibilidad, no específicos y costosos. Objetivo. Desarrollar un test qPCR múltiple que identifique tres especies patógenas de Angiostrongylus: A. cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum. Materiales y métodos. Se seleccionó la secuencia de una región ITS-2 del genoma de Angiostrongylus, previo análisis bioinformático para garantizar la especificidad del cebador y las sondas. Se extrajo el ADN de Angiostrongylus adultos (control positivo) y de larvas de nemátodos con el DNeasy® Blood&Tissue kit. La reacción usada se llevó a cabo en un termociclador Smartcycler Cepheid® utilizando un master mix QuantiTect® kit. Como controles negativos usamos ADN de otros parásitos, de humanos y de caracol africano de Santa Fe de Antioquia. Resultados. La prueba identificó sin errores cada uno de los cinco controles positivos de Angiostrongylus, procedentes de diferentes países. Los valores Ct fueron: 21 para A. cantonensis, 22 para A. costaricensis y 31 para A. vasorum. Ninguno de los controles negativos amplificó en la qPCR para 40 ciclos (Ct: 0).La temperatura de amplificación (TM) para la reacción múltiple fue de 60° C. La qPCR presentó una eficiencia de amplificación del 100 %. Conclusiones. La prueba qPCR múltiple estandarizada para tres especies de Angiostrongylus permite la identificación específica de las muestras de ADN en una sola reacción.